靶向肿瘤KRAS突变的细胞免疫疗法成功案例

体外扩增的肿瘤浸润性T淋巴细胞的过继回输治疗使得20-30%的转移性恶性黑色素瘤患者出现持续性的完全缓解。这一现象可能是由特异性靶向突变肽的T细胞介导的，这一类的特异性的突变肽是由体细胞突变产生的，称之为新抗原。使用靶向肿瘤新抗原疗法的直接证据是静脉回输95%的纯化的靶向ERBB2IP突变表位的CD4+T细胞治疗转移性胆管癌患者，出现长达35个月的肿瘤退缩。因此使用靶向肿瘤突变抗原的T细胞免疫疗法可能会使得肿瘤患者得到临床获益。

大部分的KRAS突变为热点驱动突变，其位于密码子12、13、16，其中密码子12是最常见的突变位点。在该位点的密码子G转变为D产生了KRAS G12D突变，为最常见的人胃肠道肿瘤的KRAS突变，并且在大约45%的胰腺癌及13%的结肠癌中均存在。尽管进行了大量的研究，但至仍是无法进行药物靶向治疗的突变位点。因此Rosenberg首次证实了TIL过继性细胞治疗能够靶向治疗含有这一突变的恶性肿瘤。

研究对象：

患者为50岁患有转移性结直肠癌的老年女性，有10个肺部转移灶，该临床试验，筛选并培养患者肿瘤浸润性淋巴细胞，检测其能否识别所有已知的表达在其自体肿瘤的新抗原表位。如果识别出新抗原反应性T淋巴细胞，无论其是否识别靶点新抗原，都可以作为自体细胞疗法的选择。

研究方法：

1. 分离出新抗原反应性T细胞并扩增：检测从患者获得的肿瘤浸润性T淋巴细胞能否识别转移性非肿瘤表达的体细胞新表，发现并扩增KRAS G12D突变的肿瘤浸润性CD8+ T淋巴细胞。选择含有最高比例CD8+ T细胞的肿瘤浸润性淋巴细胞，体外扩增2W。回输1.48*1011肿瘤浸润性淋巴细胞，含有大约75%的CD8+ T细胞（1.11*1011个细胞）。

2. 体内跟踪T细胞克隆：分别从治疗前的三个肺结节上、进展性病变部位和T细胞输入前后的外周血中，分离出病人治疗用的T细胞，测定基因组上的Y细胞受体β链的可变区序列，从而测定对G12D突变体有反应的T细胞受体的频率。

3. 评估T细胞受体的反应性：识别出4个对KRAS G12D突变反应性的T细胞受体。合成T细胞受体α及β链序列，之后克隆入MSGV1逆转录病毒载体，转染自体外周血T细胞。转导了TCR的T细胞与负载了多种KRAS肽的自体外周血单核细胞及含有KRAS G12D突变的胰腺癌细胞株共孵育，评估T细胞的反应性。

4. 染色体拷贝数分析：以正常样品作为参考，使用Sequenza软件确定肿瘤染色体拷贝数的畸变。按文中附录中的方法确定肿瘤HLA-C等位基因的频率。

实验结果：

1.临床评估

大部分的肿瘤反应性T细胞可以产生多种效应因子。在细胞回输后的40天随访中，CT影响数据提示所有7个肺转移灶均出现明显的肿瘤退缩。其中6个转移灶在治疗9个月后完全消退或持续缩小（图）。患者在IL-2治疗后未出现明显副反应，并在接受细胞治疗后2周出院。反应性病灶的病理分析结果提示为完全的坏死，无活的肿瘤细胞。

2. 体内KRAS G12D反应性CD8+ T细胞频率

回输至少含4种对G12D突变反应性T细胞克隆型。对KRAS G12D突变反应性T淋巴细胞频率最高的三个T细胞分别占据回输总细胞的比例为49.5%、19.1%及6.9%（图2A）。这些类型的T细胞在治疗前前1周患者的外周血中均未检测到。占回输细胞比例最高的T细胞克隆型在细胞治疗后40天并未检测到，而其他这几种类型的T细胞克隆反而可以检测到。在治疗后9个月，持续存在在外周血中的T细胞克隆分别为10.4%、4.5%及0.005%，其中最主要的T细胞克隆型为TRBV10-02突变体KRAS G12D反应性T细胞（图2A）。其中进展的肿瘤病灶中并未存在针对KRAS G12D的T细胞。

3. KRAS G12D反应性T细胞受体的敏感性及特异性

我们克隆了4种KRAS G12D反应性T细胞受体，基因编辑表达在自体外周血T细胞表面。3/4个T细胞受体对KRAS G12D肽GADGVGKSA较为敏感，而另外一个T细胞受体仅针对KRAS G12D肽GADGVGKSAL有反应（图2B）。所有的T细胞受体突变肽特异性反应，而不会识别KRAS野生型。T细胞受体识别肽的浓度在1nM-10nM（图2B）。研究发现T细胞受体可以特异性识别同时表达KRAS G12D及HLA-C*08：02的异基因胰腺癌细胞株（图2C）。

4. 肿瘤的遗传分析

全外显子及转录组测序表明，唯一一个进展的病灶仍然表达KRAS G12D突变。这一现象表明疾病的进展并不是因为靶向抗原的缺失。染色体拷贝数分析提示进展灶含有一些与其他几个在治疗前切除的病灶不同的基因异常，其中编码HLA-C*08：02等位基因的6号染色体拷贝丢失（图3）。导致被KRAS G12D反应性T细胞识别所必须的HLA限制性元件的缺失，是发生免疫逃避的直接机制。

总结：

该项研究首次证明，过继回输这种针对患者自体肿瘤突变新抗原的TIL疗法能够产生对表达该类抗原的肿瘤细胞产生明显的抗肿瘤反应。此外研究鉴定出了4中针对该突变抗原肽的TCR，从而开启了针对表达这种常见突变的多种类型的肿瘤特异性T细胞受体基因重组治疗的可能性。当然该项研究也存在一定局限性，首先为HLA限制性，这就是为什研究中12名患者中仅有一位患者产生明显的临床获益。其次，大部分中国人不是HLA-C*08：02，因此后续需要发现针对中国人HLA分型的抗原肽。本公司团队在此项目获得重要突破。正在开展临床试验。

文献来源：TranPaul F. et al. T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant

KRAS in Cancer