流式细胞术检测NK细胞杀伤活性

流式细胞术检测NK细胞杀伤活性

细胞准备：

培养的NK细胞、被杀伤的靶细胞（肿瘤细胞，常用K562）

1、靶细胞标记：CFSE冻冻干粉500mg溶解于180 ul DMSO（溶解成5mM），收集生长状态良好的靶细胞，PBS洗涤一次，用PBS重悬到5*10⁶／ml。将溶解好的CFSE溶液（5mM）加入到细胞悬液中，使终浓度为5uM（1ml细胞悬液只需加1ul）混匀细胞（用1ml枪吹混匀），于5％CO2 37℃孵育30min，中途混匀一次，加入5倍体积冷的完全培养基（先放冰水备着终止染色，冰上育5min，离心洗涤，再用完全培养基洗涤1次，细胞用培养基重悬到1*10⁶／ml；

2、效应细胞（NK）与靶细胞共培养：将处理好的效应细胞与靶细胞按不同效靶比（1：1、5：1、20：1）加入无菌的5ml流式管中，每管加入靶细胞100ul，在加入相应的效应细胞100ul（效应细胞需要重悬到不同的浓度以达到相应的效靶比），并留单独的靶细胞和效应细胞的两管做为对照，将流式管中的效应细胞与靶细胞混匀，300g／min，离心1min以使细胞紧密接触，5％CO2、37℃培养箱中孵育4h；

3、NK杀伤功能流式检测：收集流式管中的细胞，PBS洗涤一次，细胞用PBS重悬到500ul，加入5ul 7—AAD染料，室温避光孵育15min，中途混匀一次。流式上机检测CFSE⁺7——AAD⁺细胞的百分率。