人外周血Th亚群鉴定方法
细胞刺激：（刺激体系1ml）
取人外周血（肝素抗凝）200ul加入24孔板内，加入800ml的完全培养基，再加入1ul PMA（25ug / ml），1 ul lonomycin（1 mg／ml），轻轻吹打混匀细胞，放入CO2培养箱培养刺激0.5h后，每孔再加入2 ul Brefeldin A（5mg/ml），轻轻轻吹打混匀细胞，放入CO2培养箱培养刺激3.5h。
流式检测：
1、收集细胞于流式管内，500g／8min离心，粒头吸去上清，弹散管底沉淀，加入相应的表面染色抗体（CD3\CD8）弹散混匀，室温避光孵育15min后，500g／8min离心，枪头吸去上清；
2、弹散管底沉淀，加入1m1的固定／破膜工作液，（1 ml Fixation／ Permeabilization Concentrate加入3ml
Fixation／ Permeabilization Diluent 稀释），涡旋混匀，现配现用；
3．室温避光孵育30min，600g／10min离心，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清（此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀不容易丢失），弹散管底沉淀；
4、加入1 ml Permeabilization Buffer（此为10X，须与蒸馏水1：10稀释成工作液）工作液离心洗涤细胞，破膜15mn（室温避光），600g／10min，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清，弹散管底沉淀；
5、加入10 ul Permeabilization Buffer（1x），同时加入相应的细胞因子染色抗体，室温避光解育15min：
6、加1 ml Permeabilization Buffer（1x），600g／8mmn，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清，弹散管底沉淀
7、加入适量体积（建议300－500u）的PBS重悬细胞，上机检测并分析。
Tips：
1、根据据实验需求选择相应的抗体，并做单染管用于调节补偿。
2、尽量做同型对照，因细胞因子表达量不高（尤其是L－4表达量非常低），细胞因子抗体对应的同型对照一般都要做。
3、PMA刺激会导致人T细胞表面CD4表达的下调，PMA与 lonomycin联合刺激下调非常明显，4h刺激后会下调50％以上，6h刺激几乎检测不到CD4，因此我们的界定CD4+ T细胞是通过染CD3和CD8，来圈CD3+CD8-的细胞。
4、PMA对小鼠T细胞CD4表达影响响很小，因此可以直接染CD4来圈门。
5、因破膜剂对细胞损伤较大，建议离心后形成的细胞沉淀先弹散形成细胞悬液，再加入破膜剂，这样会减少对细胞的损伤（形成的细胞碎片较少）。
鉴定结果
说明：细胞破膜后对形态影响较小，因此可以直接圈淋巴门分析，再通过图CD3+CD8-的细胞来分析CD4+的细胞表达细胞因子的量。
