人NK细胞鉴定方法
1、准备细胞:取培养的细胞离心(300 g/5min),弃去上清,加入一定量PBS洗涤一次,弃去上清,弹散细胞,细胞重悬到5*106-10*106/ml之间;
2、取100ul的细胞于EP管或流式管内,加入相应的抗体,每种抗体加入5u(注意人的抗体部是加5ul,小鼠的抗体具体要看说明书),有补偿的要做单染管(若不想调节补偿可以参照以下配色方案);
3、加入相应的抗体后混匀,建议弹管子,尽量不用枪头直接吹打,室温避光孵育15min,染色过程中再混匀一次;
4、染色完成后加入1ml的PBS洗涤细胞,离心300g/5min;
5、弃去上清,弹散细胞,加入500ul PBS重悬,流式上机检测。
鉴定结果

说明:
1、此配色方案荧光颜色之间没有补偿干扰,可一起染色,不用设置单染管调节补偿。
2、NK细胞的鉴定标准是CD3-CD16+CD56+,因此本次结果鉴定的NK纯度是96.8%*77%。
3、此定方案最好有同型对照,特别是CD16和CD56要做同型对照,CD3因分群明显可以省去。
人MSC干细胞鉴定方法
1、准备细胞:取培养的细胞离心(300g/5min),弃去上清,加入一定量PBS洗涤一次,弃去上清,弹散细胞,细胞重悬到5*106-10*106/ml之间;
2、取100ml的细胞于EP管或流式管内,分三管染色,第一管Ant-human CD90 FITC,Anti-human CD105 APC,Anti-humsn CD45 PE-Cy7各加5ul;第二管Anti-human HLA-DR FITC,Anti-human CD34 PE-Cy7,Anti-human CD73 APC各加5ul、第三管 Mouse IgG1 K Isotype Control FITC 0.6ul, Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 1.2ul Mouse IgG1 Isotype Control APC 1.2 ul。
3、加入相应的抗体后混匀、建议弹管子,尽量不用枪头直接吹打,室温避光孵育15min,染色过程中再混匀一次
4、染色完成后加入1ml的PBS洗涤细胞,离心300g/5min:
5、弃去上清,弹散细胞,加入500ul PBS重悬,流式上机检测。
Tips:
1、同型对照是根据染色抗体的用量来计算的,所以每种同型对照可能加入量可能不一样。
2、先上机检测同型对照管,各检测通道以这一管的信号设为阴性,再上机检测抗体染色管。
3、最后结果的显示用峰图来表示,每种抗体的检测结果都与对应的同型对照染色结果叠加展示( overlay)。
鉴定结果

说明:CD90表达量非常高,所以建议用FITC荧光染料,FITC/PE-Cy7/APC这三种荧光染料之间几平没有补偿,所以这三种染料一起染色不需调节补偿,如果是做脐带干细胞的鉴定,CD105抗体最好选择SN6克隆号,其他克隆号色结果不好(某些克隆号染不上)。
人DC细胞鉴定方法
1、准备细胞:取培养的细胞离心(300g/5min),弃去上清,加入一定量PBS洗涤一次,弃去上清,弹散细胞,细胞重悬到5*106-10*106/ml之间;
2取100ml的细胞于EP管或流式管内,分二管染色,第一管Ant- human CD80 FITC,Anti-human CD83 APC,Anti-human CD86 PE-Cy7各加5ul;第二管 anti-human CD14 FITC.Anli- human CD40 PE-Cy7,Anti- human HLA- DR APC各加5ul;
3、加入相应的抗体后混匀,建议弹管子,尽量不用枪头直接吹打,室温避光孵育15min,染色过程中再混匀一次;
4,染色完成后加入1ml的PBS洗涤细胞,离心300g/5min;
5、弃去上清,弹散细胞,加入500ul PBS重悬,流式上机检测。
Tips:
DC细胞培养周期较长,诱导分化需要细胞因子,因此细胞比较珍贵,在细胞鉴定过程中能使用最少的细胞
得到准确的结果非常有必要,以上染色方案是经过优化,三色组合染色,对仪器要求不高(两激光四通道即
可,几乎所有实验室都能达到要求),且不需调节补偿,对结果不影响。
鉴定结果

说明:以上配色方案只需两管染色,不用调节补偿。细胞 maker表达量的鉴定应与同型对照比较。